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Coloration de GRAM


Date de la dernière modification
: 21-04-2017

Hans Christian Joachim GRAM : Médecin bactériologiste danois (1853 - 1938). La coloration de Gram permet de distinguer deux catégories de germes, ceux qui prennent la coloration, dits Gram + (violets) et ceux qui ne la prennent pas, dits gram - (roses).  

A - MATÉRIEL  

  * Boîtes de Pétri ensemencées lors de la séance précédente.

  * Cuve à coloration, violet de gentiane (violet de cristal), lugol, alcool dans flacon compte-gouttes.

  * Fuchsine de Ziehl au 1/10e, pissette avec eau, öses, eau de Javel.

  * Microscopes, lames, lamelles, lames dégraissées et lames rodées, matériel pour immersion.

B - COLORATION DE GRAM  

Éviter tout contact avec les bactéries, ou laver immédiatement à l'eau de Javel ! 

  

  

  * Avec une öse stérile, prélever, dans la zone stérile du bec, des bactéries de la boîte de Pétri.

  * Les diluer dans une goutte d'eau, sur une lame dégraissée. Ne pas trop étaler.

  * Stériliser l'öse à la flamme, la placer dans la galerie.

  * Faire un frottis avec une lame rodée. Réduire la flamme du bec en veilleuse. Fixer à la chaleur.

  

 

  * Poser le frottis sur la cuve à coloration.

  * Couvrir de violet de gentiane pendant 1 minute. Laver à l'eau ordinaire (pissette).

  * Couvrir de lugol pendant 1 minute. Laver à l'eau ordinaire.

  * Différenciation à l'alcool : (15 à 20 secondes maximum !) On verse l'alcool goutte à goutte sur le bout de la lame inclinée. On arrête quand l'alcool arrive incolore au bas de la lame. Rinçage immédiat à l'eau ordinaire.

  * Couvrir de fuchsine de Ziehl au 1/10e pendant 30 secondes. Laver à l'eau ordinaire et laisser sécher à l'air.

C - OBSERVATION AU MICROSCOPE  

Les effets de la coloration de Gram :

Le violet de gentiane colore le cytoplasme. Chez les bactéries dont la membrane possède beaucoup d'acides techoïques et peu de lipides, l'alcool ne traverse pas cette membrane et le cytoplasme reste violet. Ces bactéries sont dites Gram +.

D'autres bactéries ont une membrane ne possédant pas d'acides techoïques mais beaucoup de lipides. L'alcool traverse la membrane et lave le violet de gentiane. Pendant la coloration suivante à la fuchsine de Ziehl, le cytoplasme se colore en rose. Ces bactéries sont dites Gram -.

La coloration de Gram est régulièrement effectuée dans tous les laboratoires de bactériologie, car elle permet une première sélection lors de la détermination, souvent délicate, d'un germe. Au microscope à immersion, cette distinction entre bactéries roses et bactéries violettes est relativement facile à faire.


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