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sur milieu solide et milieu liquide

Avec le coffret "Institut Pasteur"


Date de la dernière modification
: 25-04-2017  

A - MATÉRIEL  

* Coffret "Institut Pasteur" : tubes 1 (bacilles = Enterobacter cloacae) et 2 (streptocoques = Streptococcus fœcalis), C1 et C2 (bouillon nutritif), D1 et D2 (gélose nutritive).

* Galerie, pipettes Pasteur, öses bouclées, becs Bunsen.

Remarque : on peut acheter le bouillon nutritif et la gélose nutritive dans le commerce, ou même la fabriquer soi-même (voir annexes). On peut également se procurer les souches de bactéries dans un laboratoire d'analyses biologiques et médicales.

B - PRÉPARATION DES TUBES DE MILIEU LIQUIDE  

* Débloquer les bouchons des tubes 1 et 2 (bacilles et streptocoques).

* Casser l'extrémité d'une pipette Pasteur et la passer rapidement à la flamme.

 

   * Déboucher le tube 1 (bacilles) et prélever stérilement une goutte de liquide avec la pipette Pasteur.

   * Passer rapidement l'ouverture du tube 1 à la flamme avant de le refermer.

   * Ouvrir le tube C1 de bouillon nutritif et déposer la goutte prélevée dans le tube 1.

   * Passer l'ouverture du tube C1 à la flamme avant de le refermer sans serrer le bouchon.

   * Recommencer toutes ces opérations avec les tubes 2 (streptocoques)  et C2.

C - PRÉPARATION DES TUBES DE MILIEU SOLIDE 

* Les tubes D1 et D2 ont été préalablement fondus puis refroidis inclinés.

* Passer une öse bouclée à la flamme, puis prélever l'inoculum dans le tube 1.

* Passer l'ouverture du tube 1 à la flamme avant de le refermer.

 

* Ouvrir le tube D1 et l'ensemencer en stries ascendantes (schéma). Le refermer sans serrer.

* Recommencer toutes ces opérations avec les tubes 2 et D2.

* Tous les tubes C1, C2, D1 et D2 sont mis à l'étuve (18 à 24 h à 37°C ou 3 jours à 20°C).

TECHNIQUE DU TRANSFERT A L'ÖSE

   Le tube de départ est saisi de la main gauche entre pouce et index. L'öse est saisie de la main droite, comme un crayon, stérilisée à la flamme et refroidie dans la zone de stérilité du bec Bunsen. Le tube de départ est présenté, orifice vers la zone de protection, et est débouché à l'aide du petit doigt de la main tenant l'öse.

   L'orifice du tube et le bouchon doivent rester dans la zone de protection et ne toucher aucun objet. On flambe l'orifice du tube pour détruire les germes pouvant s'y trouver. L'öse est alors introduite dans le tube sans toucher les bords.

   Le prélèvement est effectué soit par grattage d'une colonie à l'aide de la boucle (sans abîmer la gélose), soit par trempage de la seule boucle dans un milieu liquide. L'öse est ensuite retirée sans toucher les parois ; le bord du tube est à nouveau flambé et le bouchon remis. Pendant cette opération, l'öse chargée de germes ne doit ni sortir de la zone stérile, ni pénétrer dans la flamme du bec.

   L'opération est renouvelée avec le tube d'ensemencement vierge qui est débouché et dans lequel on fait pénétrer l'öse.

- S'il s'agit d'un milieu liquide, la boucle est agitée légèrement en surface du milieu en raclant les bords du tube pour bien libérer et répartir l'inoculum. 

- S'il s'agit d'une gélose inclinée, la boucle va se poser au fond du tube, à la surface de la gélose et l'inoculum est déposé en stries ascendantes régulières sans rayer la gélose.

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